Bioprinter de baix cost: 13 passos (amb imatges)

2024 Autora: John Day | [email protected]. Última modificació: 2024-01-30 08:13

Som un equip de recerca dirigit per estudiants de la UC Davis. Formem part del grup BioInnovation, que opera al laboratori TEAM Molecular Prototyping and BioInnovation (assessors del Dr. Marc Facciotti i Andrew Yao, M. S.). El laboratori reuneix estudiants d’orígens diversos per treballar en aquest projecte (enginyeria mecànica / química / biomèdica).

Una mica d’antecedents d’aquest projecte és que vam començar a imprimir cèl·lules d’arròs transgènic en col·laboració amb la Dra. Karen McDonald, del departament de ChemE, amb l’objectiu de desenvolupar una bioimpressora de baix cost per fer la bioimpressió més accessible a les institucions de recerca. Actualment, les bioimpressores de gamma baixa costen aproximadament 10.000 $ mentre que les bioimpressores de gamma alta costen aproximadament 170.000 $. En canvi, la nostra impressora es pot construir per aproximadament 375 $.

Subministraments

Parts:

1. Rampes 1.4:
2. Arduino mega 2560:
3. Controladors de motor pas a pas:
4. Motor pas a pas addicional (opcional)
5. Mànega del fabricant 2 en X 1 polzada
6. Maquinari de fixació de feix Maker
7. Cargols M3 de diferents mides
8. Femelles M3 x2
9. Vareta roscada de 8 mm
10. Femella de 8 mm
11. 608 rodament
12. Clip d’aglutinant
13. Filament
14. Monoprice V2
15. Corbates amb cremallera
16. M3 femelles de joc de calor d'amplada de 2 mm

Eines:

1. Broques de diverses mides
2. Trepant de mà
3. Premsa de trepant
4. Serra mecànica
5. Soldador + soldador
6. Decapant de filferro
7. Tenalles d'agulla
8. Tecles hexagonals de diverses mides

Subministraments de laboratori:

1. Plats Petri ~ 70 mm de diàmetre
2. Xeringa de 60 ml amb punta Luer-lock
3. Xeringa de 10 ml amb punta Luer-lock
4. Accessoris Luer-Lock
5. Tubs per a accessoris
6. Connector T per a tubs
7. Centrífuga
8. Tubs de centrifugació de 60 ml
9. Escala
10. Pesar vaixells
11. Autoclau
12. Gots de precipitats
13. Cilindre graduat
14. Solució de CaCl2 0,1M
15. Agarosa
16. Alginat
17. Metilcel·lulosa
18. Sacarosa

Programari:

1. Fusion 360 o Solidworks
2. IDE Arduino
3. Amfitrió de repetició
4. Ultimaker Cura 4

Pas 1: Selecció d'una impressora 3D

Vam triar la impressora 3D Monoprice MP Select Mini V2 com a impressora 3D inicial. Aquesta impressora s'ha seleccionat pel seu baix cost i la seva alta disponibilitat. A més, ja hi havia disponible un model 3D molt precís de la impressora que facilitava el disseny. Aquesta instrucció s'adaptarà a aquesta impressora específica, però es pot utilitzar un procés similar per convertir altres impressores FDM i màquines CNC habituals.

Model d'alta precisió:

Pas 2: impressió 3D

Abans de desmuntar la impressora Monoprice, cal imprimir diverses parts en 3D per modificar la impressora 3D. Hi ha versions de les extrusores de pasta, una que requereix epoxi i una que no. El que requereix epoxi és més compacte però més difícil de muntar.

Pas 3: prepareu la impressora per modificar-la

Cal retirar el tauler frontal de la torre, la coberta inferior i el tauler de control. Un cop retirada la part inferior, desconnecteu tots els aparells electrònics de la placa de control i traieu-la.

Pas 4: muntatge intercanviable

El cos 1 i el cos 14 necessiten cadascun dos fruits secs. El cos 1 està muntat al marc de la impressora mitjançant els dos perns M3 amagats sota el cinturó. Els cargols es poden revelar traient el tensor de la corretja i estirant la corretja cap a un costat.

Pas 5: commutador de l'eix Z

El commutador de l'eix Z es torna a col·locar de manera que es pugui utilitzar qualsevol agulla de longitud durant la seqüència de retorn sense compensar al programari. L'interruptor s'ha de muntar amb 2 cargols M3 al xassís de la impressora directament sota el capçal d'impressió el més a prop possible del llit d'impressió.

Pas 6: cablejat

El cablejat es realitza d’acord amb les normes Ramps 1.4. Simplement seguiu l'esquema de cablejat. Tallar i estanyar els cables segons sigui necessari per als blocs de terminals. És possible que calgui ampliar alguns cables.

Pas 7: extrusora epoxi

Tot i que aquesta extrusora triga menys a imprimir, utilitza epoxi que augmenta el temps total de construcció a més de 24 hores. La vareta roscada de 8 mm s’hauria d’epoxiar al coixinet 608 i el coixinet s’ha d’epoxiar a la peça impresa en 3D Cos 21. A més, la femella de la vareta roscada s’ha d’epoxiar al cos 40. Un cop s’ha curat l’epoxi, la goma es poden instal·lar puntes dels pistons de xeringa de 60 ml i 10 ml sobre el cos 9 i el cos 21, respectivament. No es va poder trobar una connexió T adequada, de manera que es va fabricar una bruta amb tubs de llautó de 6 mm i soldadura. L’extrusora actua com un sistema hidràulic que empeny el Bioink fora de la cambra inferior de la xeringa de 10 ml. Es pot evacuar l’aire del sistema sacsejant vigorosament els tubs mentre es manté l’acoblament T al punt més alt.

Pas 8: extrusor de pasta regular

Aquesta extrusora simplement es pot cargolar. L’inconvenient d’aquest extrusor és que és més voluminós i té una gran reacció.

Pas 9: Pas 9: Firmware Arduino

L'Arduino necessita microprogramari per executar els controladors pas a pas i altres components electrònics. Vam triar Marlin, ja que és gratuït, es pot modificar fàcilment amb Arduino IDE i està ben suportat. Hem modificat el microprogramari del nostre maquinari específic, però és molt senzill modificar-lo per a altres impressores perquè es comenten i s’expliquen clarament tot el codi. Feu doble clic al fitxer MonopriceV2BioprinterFirmware.ino per obrir els fitxers de configuració del marlin.

Pas 10: Cura del perfil

El perfil Cura es pot importar a Ultimaker Cura 4.0.0 i utilitzar-lo per fabricar malles d'alta superfície per utilitzar-les en un reactor de profusió. La generació de Gcode per a la impressora és encara molt experimental i requereix molta paciència. També s’adjunta un gcode de prova per a un reactor de profusió circular.

Pas 11: Canviar el codi G d'inici

Enganxeu aquest codi a la configuració inicial del codi G:

G1 Z15

G28

G1 Z20 F3000

G92 Z33.7

G90

M82

G92 E0

A Repetier, per modificar el Gcode d’inici, aneu a slicer-> Configuració-> Codis G-> inicieu els codis G. Cal modificar el valor G92 Z per a cada cas concret. Augmenteu lentament el valor fins que l’agulla estigui a la distància desitjada de la superfície de la placa Petri al començament de la impressió.

Pas 12: elaboració del Bioink

El procés per desenvolupar un Bioink adequat per a una aplicació és complex. Aquest és el procés que hem seguit:

Resum

L’hidrogel és adequat per a cèl·lules vegetals sensibles al cisallament i té macropors oberts per permetre la difusió. L’hidrogel es fabrica dissolent l’agarosa, l’alginat, la metilcel·lulosa i la sacarosa en aigua desionitzada i afegint cèl·lules. El gel és viscós fins que es cura amb clorur de calci 0,1 M, cosa que el fa resistent. La solució de curació de clorur de calci s’enllaça amb l’alginat per fer-lo robust. L’alginat és la base del gel, la metilcel·lulosa homogeneïtza el gel i l’agarosa proporciona més estructura ja que es gelifica a temperatura ambient. La sacarosa proporciona aliment perquè les cèl·lules continuïn creixent a l’hidrogel.

Una breu visió general d'alguns dels experiments per verificar el gel

Hem provat diferents hidrogels amb diferents quantitats d’agarosa i hem registrat la seva consistència, la facilitat amb què s’imprimeix i si s’enfonsa o flota a la solució de curació. La disminució del percentatge d’alginat va fer que el gel fos massa líquid i no va poder mantenir la seva forma després de la impressió. L’augment del percentatge d’alginat va fer que la solució de curat funcionés tan ràpidament que el gel es curés abans d’enganxar-se a la capa superior. Un hidrogel que manté la seva forma i no cura massa ràpidament es va desenvolupar amb un 2,8% d'alginat en pes.

Com desenvolupar un hidrogel

Materials

Agarosa (0,9% en pes)

Alginat (2,8% en pes)

Metilcelulosa (3,0% en pes)

Sacarosa (3,0% en pes)

Clorur de calci.1M (147.001 g / mol)

ddH20

agregats cel·lulars

2 vasos de precipitats rentats i secs

1 Mesclant espàtula

Paper d'alumini

Paper de pes de plàstic

Cilindre graduat

Procediment

Fabricació de l’Hidrogel:

1. Mesureu una quantitat específica de ddH20 en funció de la quantitat de solució de gel que vulgueu preparar. Utilitzeu el cilindre graduat per obtenir un volum específic de ddH20.
2. La solució d’hidrogel contindrà alginat (2,8% en pes), agarosa (0,9% en pes), sacarosa (3% en pes) i metilcel·lulosa (3% en pes). Les porcions adequades dels components de la solució d’hidrogel es mesuraran amb el paper de plàstic.
3. Quan hàgiu acabat de pesar tots els components, afegiu ddh20, sacarosa, agarosa i, finalment, alginat de sodi a un dels vasos de precipitats secs. Remeneu-ho per barrejar, però no utilitzeu una espàtula perquè la pols s’enganxi a l’espàtula.
4. Un cop barrejat, emboliqueu bé la part superior del got amb paper d'alumini i etiqueteu el got. Afegiu un tros de cinta d’autoclau a la part superior de la làmina.
5. Introduïu la metilcel·lulosa restant a l’altre vas de precipitats sec i emboliqueu-lo amb paper d’alumini com el vas de precipitats anterior. Etiqueu aquest vas de precipitats i afegiu un tros de cinta d’autoclau a la part superior de la làmina.
6. Emboliqueu 1 espàtula amb paper d'alumini i assegureu-vos que no n'hi hagi cap exposada. Afegiu cinta d’autoclau a l’espàtula embolicada.
7. Autoclavar els 2 vasos de precipitats i 1 espàtula a 121 ° C durant 20 minuts durant el cicle d’esterilització. NO USEU L'AUTOCLAVA EN CICLE ESTÈRIL I SEC.
8. Un cop completat el cicle de l’autoclau, deixeu que el gel es refredi a temperatura ambient i, un cop l’hagi assolit, comenceu a funcionar al gabinet de seguretat biològica.
9. Assegureu-vos de rentar-vos les mans i els braços i utilitzar la tècnica asèptica adequada un cop hàgiu operat a l’armari de bioseguretat. A més, assegureu-vos de no entrar en contacte directe amb objectes que toquin el gel o que estiguin a prop del gel (per exemple: l’extrem de barreja de l’espàtula o la regió de les làmines d’alumini que s’assenta sobre el gel).
10. Al gabinet de bioseguretat barregeu la metilcelulosa amb el gel per aconseguir una distribució homogènia. Un cop acabada la barreja, torneu a embolicar la part superior de la solució de gel barrejat i poseu-la a la nevera durant la nit.
11. A partir d’aquí el gel es pot utilitzar per a la introducció de cèl·lules o per a altres usos com la impressió.

Afegir les cel·les:

1. Filtra les cel·les perquè tinguin la mateixa mida. El nostre procediment de filtratge és

   Raspeu lleugerament les cèl·lules de la placa Petri i utilitzeu un tamís de 380 micròmetres per filtrar les cèl·lules.

2. Barregeu suaument les cèl·lules filtrades a la solució d’hidrogel amb una espàtula plana per evitar la pèrdua de la barreja (que s’ha autoclavat).
3. Després de barrejar les cèl·lules, centrifugueu les bombolles
4. A partir d’aquí, l’hidrogel es completa i es pot utilitzar per imprimir, curar i realitzar futurs experiments.

Com desenvolupar la solució de curació (clorur de calci 0,1 M, CaCl2)

Materials

Clorur de calci

ddH20

Sacarosa (3% en pes)

Procediment (per fer una solució de curat de 1L)

1. Mesureu 147,01 g de clorur de calci, 30 ml de sacarosa i 1 litre de ddH20.
2. Barregeu clorur de calci, sacarosa i ddH20 en un got o recipient gran.
3. Submergiu el gel en la solució curativa durant almenys 10 minuts per curar.

Pas 13: imprimeix

En teoria, la bioimpressió és extremadament senzilla; no obstant això, a la pràctica, hi ha molts factors que poden provocar fallades. Amb aquest gel, hem descobert que es poden fer diverses coses per maximitzar l’èxit de la nostra aplicació:

1. Utilitzeu petites quantitats de solució de CaCl2 per curar parcialment el gel mentre imprimiu,
2. Utilitzeu una tovallola de paper a la part inferior de la placa de Petri per augmentar l’adherència
3. Utilitzeu una tovallola de paper per repartir de manera uniforme petites quantitats de CaCl2 per tota la impressió
4. utilitzeu el control lliscant de cabal a Repetier per trobar el cabal correcte

Per a diferents aplicacions i gels diferents, pot ser que calgui utilitzar diferents tècniques. El nostre procediment es va generar durant diversos mesos. La paciència és clau.

Bona sort si proveu aquest projecte i no dubteu a fer cap pregunta.

Primer premi del Concurs Arduino 2019