Microscopi Gigapixel d'escriptori: 10 passos (amb imatges)

2024 Autora: John Day | [email protected]. Última modificació: 2024-01-30 08:14

En els microscopis òptics, hi ha una compensació fonamental entre el camp de visió i la resolució: com més petit és el detall, més petita és la regió del microscopi. Una manera de superar aquesta limitació és traduir la mostra i adquirir imatges en un camp de visió més gran. La idea bàsica és unir moltes imatges d’alta resolució per formar un FOV gran. En aquestes imatges, podeu veure tant la mostra completa com els detalls detallats de qualsevol porció de la mostra. El resultat és una imatge que consisteix en aproximadament mil milions de píxels, molt més gran en comparació amb les fotografies fetes per un dSLR o un telèfon intel·ligent, que solen tenir entre 10 i 50 milions de píxels. Mireu aquests paisatges de gigapíxels per obtenir una demostració impressionant de la quantitat massiva d'informació d'aquestes imatges.

En aquest instructiu, examinaré com construir un microscopi capaç d’imaginar un camp de visió de 90 mm x 60 mm amb píxels corresponents a 2 μm a la mostra (tot i que crec que la resolució és probablement més propera a 15 μm). El sistema utilitza lents de càmera, però es pot aplicar el mateix concepte mitjançant objectius del microscopi per obtenir una resolució encara més fina.

Vaig penjar les imatges de gigapíxels que vaig adquirir amb el microscopi a EasyZoom:

Imatge de la revista National Geographic de 1970

Estovalles de ganxet que va fer la meva dona

Electrònica diversa

Altres recursos:

Tutorials de microscòpia òptica:

Resolució òptica:

A més de la unió d'imatges, els recents avenços en imatge computacional fan possible la microscòpia de gigapíxels sense ni tan sols moure la mostra.

Pas 1: llista de subministraments

Materials:

1. Nikon dSLR (he utilitzat la meva Nikon D5000)

2. Objectiu de 28 mm de distància focal amb roscat de 52 mm

3. Objectiu de distància focal de 80 mm amb roscat de 58 mm

4. Acoblador invers de 52 mm a 58 mm

5. Trípode

6. Set fulls de fusta contraxapada de 3 mm de gruix

7. Arduino Nano

8. Dos ponts H L9110

9. Dos emissors d’IR

10. Dos receptors IR

11. Premeu el botó

12. Dues resistències de 2,2kOhm

13. Dues resistències de 150Ohm

14. Una resistència d'1kOhm

15. Alliberament remot de la càmera Nikon

16. Cartell negre

17. Kit de maquinari:

18. Dos motors pas a pas (he utilitzat motor pas bipolar Nema 17 3,5V 1A)

19. Dos cargols de plom de 2 mm

20. Quatre blocs de coixins

21. Dues femelles de cargol de plom

22. Dos casquets de rodament i eixos lineals de 200 mm:

23. Font d'alimentació de 5V:

24. Filferro de filferro

Eines:

1. Tallador làser

2. Impressora 3D

3. Claus Allen

4. Talladors de filferro

5. Eina per embolicar filferro

Pas 2: Visió general del sistema

Per traduir la mostra, dos motors pas a pas alineats en direccions ortogonals mouen una etapa en la direcció x i y. Els motors es controlen mitjançant dos ponts H i un Arduino. Un sensor IR situat a la base del motor pas a pas s’utilitza per posar a zero les etapes, de manera que no entren en cap dels extrems dels blocs. Un microscopi digital se situa per sobre de l’etapa XY.

Un cop la mostra estigui situada i l’escenari centrat, premeu un botó per començar l’adquisició. Els motors mouen l’escenari cap a l’angle inferior esquerre i s’activa la càmera. Els motors tradueixen la mostra en petits passos, ja que la càmera fa una foto en cada posició.

Després de prendre totes les imatges, les imatges es combinen per formar una imatge de gigapíxels.

Pas 3: Muntatge del microscopi

Vaig fer un microscopi de baix augment amb un dSLR (Nikon 5000), un objectiu Nikon de 28 mm f / 2,8 i un objectiu de zoom Nikon de 28 a 80 mm. L'objectiu del zoom s'ha configurat per a una distància focal igual a 80 mm. El conjunt de les dues lents actua com una lent de tub de microscopi i una lent objectiva. L'ampliació total és la proporció de les distàncies focals, al voltant de 3X. Aquestes lents realment no estan dissenyades per a aquesta configuració, de manera que per fer que la llum es propagui com un microscopi, heu de col·locar una parada d'obertura entre les dues lents.

Primer, munteu l’objectiu de distància focal més gran a la càmera. Retalleu un cercle de cartell negre que tingui un diàmetre aproximadament de la mida de la superfície frontal de l’objectiu. A continuació, talla un petit cercle al mig (he triat uns 3 mm de diàmetre). La mida del cercle determinarà la quantitat de llum que entra al sistema, també anomenada obertura numèrica (NA). El NA determina la resolució lateral del sistema per als microscopis ben dissenyats. Llavors, per què no utilitzar un NA alt per a aquesta configuració? Bé, hi ha dues raons principals. En primer lloc, a mesura que augmenta la NA, les aberracions òptiques del sistema es tornen més importants i limitaran la resolució del sistema. En una configuració no convencional com aquesta, probablement serà el cas, de manera que augmentar la NA finalment ja no ajudarà a millorar la resolució. En segon lloc, la profunditat de camp també depèn de la NA. Com més alta sigui la NA, menor serà la profunditat de camp. Això fa que sigui difícil enfocar objectes que no siguin plans. Si el NA augmenta massa, es limitarà a les diapositives de microscopi per imatge, que tenen mostres primes.

El posicionament de l’obertura entre les dues lents fa que el sistema sigui aproximadament telecèntric. Això significa que l'ampliació del sistema és independent de la distància de l'objecte. Això esdevé important per unir imatges. Si l'objecte té una profunditat variable, la vista des de dues posicions diferents tindrà una perspectiva canviada (com la visió humana). Unir imatges que no provenen d’un sistema d’imatges telecèntriques és un repte, sobretot amb un augment tan elevat.

Utilitzeu l’acoblador invers de l’objectiu de 58 mm a 52 mm per fixar l’objectiu de 28 mm a l’objectiu de 80 mm amb l’obertura situada al centre.

Pas 4: Disseny escènic XY

Vaig dissenyar l’escenari amb Fusion 360. Per a cada direcció d’escaneig, hi ha quatre parts que s’han d’imprimir en 3D: muntatge de muntatge, dos extensors d’unitat de lliscament i muntatge de cargol de plom. La base i les plataformes de l’escenari XY estan tallades amb làser de fusta contraxapada de 3 mm de gruix. La base conté el motor i els lliscadors de direcció X, la plataforma X sosté el motor i els lliscadors de direcció Y i la plataforma Y sosté la mostra. La base consta de 3 fulls i les dues plataformes de 2 fulls. Els fitxers de tall per làser i impressió 3D es proporcionen en aquest pas. Després de tallar i imprimir aquestes peces, ja esteu preparats per als passos següents.

Pas 5: muntatge del muntatge del motor

Utilitzeu una eina d’envolupament de filferro per enrotllar els cables de dos emissors d’IR i dos receptors d’IR. Codi de colors dels cables per saber quin extrem és quin. A continuació, talleu els cables dels díodes, de manera que només s’executin els cables d’embolcall de filferro. Feu lliscar els cables a través de les guies del suport del motor i, a continuació, empenyeu els díodes al seu lloc. Els cables estan dirigits de manera que no siguin visibles fins que surten de la part posterior de la unitat. Aquests cables es poden unir amb els cables del motor. Ara munteu el motor pas a pas mitjançant quatre perns M3. Repetiu aquest pas per al segon motor.

Pas 6: Muntatge de l'etapa

Enganxeu els talls de la base 1 i la base 2, un d’ells amb obertures hexagonals per a les femelles M3. Un cop la cola s’ha assecat, martellegeu les femelles M3 a la seva posició. Les femelles no giraran quan es premen al tauler, de manera que podreu cargolar els cargols més endavant. Ara enganxeu el tercer full base (base 3) per tapar les femelles.

Ara és el moment de muntar la fixació de la femella de plom. Esborreu qualsevol filament addicional de la muntura i, a continuació, premeu quatre femelles M3 a la seva posició. S’ajusten molt bé, així que assegureu-vos d’eliminar l’espai dels cargols i les femelles amb un petit tornavís. Quan les femelles estiguin alineades, empenyeu la femella principal al muntatge i fixeu-la amb 4 perns M3.

Col·loqueu els blocs de coixí, els suports lliscants i el suport del motor per al traductor lineal de direcció X a la base. Col·loqueu el conjunt de la femella de plom al cargol de plom i feu lliscar el cargol de plom al seu lloc. Utilitzeu l’acoblador per connectar el motor al cargol principal. Col·loqueu les unitats de lliscament a les barres i, a continuació, empenyeu les barres als suports de lliscament. Finalment, poseu els extensors de muntatge lliscant amb perns M3.

Les làmines de fusta contraxapada X1 i X2 s’enganxen de manera similar a la base. Es repeteix el mateix procediment per al traductor lineal de direcció Y i l'etapa de mostra.

Pas 7: electrònica de l'escàner

Cada motor pas a pas té quatre cables connectats a un mòdul de pont H. Els quatre cables de l’emissor i el receptor d’IR estan connectats a les resistències segons el diagrama anterior. Les sortides dels receptors estan connectades a les entrades analògiques A0 i A1. Els dos mòduls de pont H estan connectats al pin 4-11 de l’Arduino Nano. Es connecta un polsador al pin 2 amb una resistència d'1 kOhm per a una entrada d'usuari senzilla.

Finalment, el botó d'activació del DSLR està connectat a un obturador remot, tal com vaig fer per al meu escàner CT (vegeu el pas 7). Tallar el cable de l'obturador remot. Els cables s’etiqueten de la següent manera:

Groc: focus

Obturador vermell

Blanc - terra

Per enfocar el tret, cal connectar el fil groc a terra. Per fer una fotografia, tant el cable groc com el vermell han d’estar connectats a terra. Vaig connectar un díode i el cable vermell al pin 12 i, a continuació, vaig connectar un altre díode i el cable groc al pin 13. La configuració és la que es descriu a DIY Hacks i How-Tos.

Pas 8: Adquisició d'imatges Gigapixel

S'adjunta el codi del microscopi gigapíxel. Vaig utilitzar la biblioteca Stepper per controlar els motors amb el pont H. Al principi del codi, heu d’especificar el camp de visió del microscopi i el nombre d’imatges que voleu adquirir en cada direcció.

Per exemple, el microscopi que vaig fer tenia un camp de visió d’uns 8,2 mm x 5,5 mm. Per tant, vaig dirigir els motors a canviar 8 mm en la direcció x i 5 mm en la direcció y. S'adquireixen 11 imatges en cada direcció, que sumen 121 imatges per a la imatge completa de gigapíxels (més detalls sobre això al pas 11). A continuació, el codi calcula el nombre de passos que han de fer els motors per traduir l’escenari en aquesta quantitat.

Com saben les etapes en què es relacionen amb el motor? Com es tradueixen les etapes sense colpejar cap dels dos extrems? Al codi de configuració, he escrit una funció que mou l’escenari en cada direcció fins que trenca el camí entre l’emissor IR i el receptor IR. Quan el senyal del receptor IR baixa per sota d'algun llindar, el motor s'atura. A continuació, el codi fa un seguiment de la posició de l’escenari en relació amb aquesta posició inicial. El codi està escrit perquè el motor no es tradueixi massa lluny, cosa que faria que l’escenari entri a l’altre extrem del cargol principal.

Un cop es calibra l’escenari en cada direcció, es tradueix al centre. Amb un trípode, vaig col·locar el microscopi dSLR sobre l’escenari. És important alinear el camp de la càmera amb les línies creuades de l'escenari de mostra. Una vegada que l’escenari s’alinea amb la càmera, vaig gravar l’escenari amb una cinta de pintor i després vaig col·locar la mostra a l’escenari. El focus es va ajustar amb la direcció z del trípode. A continuació, l'usuari prem el botó per iniciar l'adquisició. L'escenari es tradueix a l'extrem inferior esquerre i s'activa la càmera. A continuació, el raster escena la mostra mentre la càmera fa una foto a cada posició.

També s’adjunta un codi per resoldre problemes de motors i sensors IR.

Pas 9: unir imatges

Amb totes les imatges adquirides, s’enfronta ara al repte de combinar-les totes. Una manera de manejar la unió d'imatges és alinear manualment totes les imatges en un programa gràfic (he utilitzat el gràfic d'Autodesk). Definitivament, això funcionarà, però pot ser un procés dolorós i les vores de les imatges es noten a les imatges de gigapíxels.

Una altra opció és utilitzar tècniques de processament d’imatges per unir les imatges automàticament. La idea és trobar funcions similars a la secció de superposició de les imatges adjacents i, a continuació, aplicar una transformació de traducció a la imatge perquè les imatges estiguin alineades entre si. Finalment, es poden barrejar les vores multiplicant la secció de superposició per un factor de pes lineal i sumant-les. Aquest pot ser un algorisme descoratjador per escriure si no coneixeu el processament d'imatges. Vaig treballar una estona en el problema, però no vaig poder obtenir un resultat completament fiable. L’algoritme va lluitar més amb mostres que tenien funcions molt similars, com ara els punts de la imatge de la revista. Adjuntem el codi que vaig escriure a Matlab, però necessita una mica de feina.

L'última opció és utilitzar programes de costura de fotografia gigapíxel. No en tinc cap per suggerir, però sé que hi són.

Pas 10: rendiment del microscopi

Per si no l’heu perdut, aquí teniu els resultats: imatge de la revista, estovalles de ganxet i electrònica diversa.

Les especificacions del sistema es detallen a la taula anterior. Vaig provar de fer imatges amb un objectiu de 28 mm i 50 mm de distància focal. Vaig estimar la millor resolució possible del sistema basant-me en el límit de difracció (al voltant de 6 μm). En realitat, és difícil provar-ho de manera experimental sense un objectiu d'alta resolució. Vaig provar d'imprimir un fitxer vectorial que apareix en aquest fòrum de fotografia de gran format, però la resolució de la meva impressora em va limitar. El millor que vaig poder determinar amb aquesta impressió va ser que el sistema tenia una resolució <40 μm. També vaig buscar característiques petites i aïllades a les mostres. La característica més petita de la revista de la revista és la tinta, que vaig estimar també a uns 40 μm, de manera que no la vaig poder utilitzar per obtenir una millor estimació de la resolució. Hi havia petits divots a l’electrònica força aïllats. Com que coneixia el camp de visió, podia comptar el nombre de píxels que ocupaven el petit divot per obtenir una estimació de la resolució, d’uns 10-15 μm.

En general, estava satisfet amb el rendiment del sistema, però tinc algunes notes per si voleu provar aquest projecte.

Estabilitat de l’escenari: en primer lloc, obtingueu components lineals d’escenari d’alta qualitat. Els components que vaig fer servir tenien molt més joc del que pensava. Només he utilitzat un dels muntatges lliscants del kit per a cada barra, així que potser per això l’escenari no se sentia molt estable. L’escenari va funcionar prou bé per a mi, però això seria més un problema per als sistemes d’augment més elevats.

Icsptica per a una resolució més alta: la mateixa idea es pot utilitzar per a microscopis de major augment. Tanmateix, caldran motors més petits amb una mida de pas més fina. Per exemple, un augment de 20X amb aquest dSLR donaria lloc a un camp de visió d'1 mm (si el microscopi pot imaginar un sistema tan gran sense vinyetatge). Electronupdate va utilitzar motors pas a pas d’un reproductor de CD en una bona versió per a un microscopi de major augment. Un altre compromís serà la poca profunditat de camp, la qual cosa significa que la imatge es limitarà a mostres primes i que necessitareu un mecanisme de traducció més fi en la direcció z.

Estabilitat del trípode: aquest sistema funcionaria millor amb un muntatge de càmera més estable. El sistema de lents és pesat i el trípode està inclinat 90 graus des de la posició per a la qual està dissenyat. Vaig haver de gravar els peus del trípode per ajudar a estabilitzar. L'obturador també podria sacsejar la càmera prou com per difuminar les imatges.